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藻膽色素提取實驗
發布時間:2020/07/17 13:16:56

實驗摘要

重組藻膽色素可作為一種較安全、可替代的藥品應用于器官移植、抗炎癥等方面的治療領域。目前利用基因工程技術生產重組藻膽色素制備工藝相對簡單、成本相對較低,具有大規模制備的潛在價值。本研究利用多基因組合表達技術,以大腸桿菌體內血紅素為底物,通過外源導入含有hox1和pcyA基因的不同表達載體,在大腸桿菌體內構建藻膽素的生物合成途徑,從而用于重組藻膽色素的規模制備。

實驗所需材料與方法

1.實驗原理

由于光合作用,藻類進化出了具有特定結構和功能的捕光天線系統,以紅藍藻為主的藻膽蛋白體系。藻膽蛋白是由藻膽色素與相應的脫輔基蛋白共價結合形成的,主要存在于藍藻、紅藻等細胞內,在光合作用過程中起到吸收和傳遞能量的作用。

藻膽色素是一類線性四吡咯化合物(分子量約600Da)。藻膽體中一般含有300~800個共價偶聯的藻膽色素。與藍藻藻膽蛋白結合的色素有4種。這四種色素分別是:藻紅膽素(phycoerythrobilin,簡稱PEB)主要存在于PE中,藻藍膽素(phycocyanobilin,簡稱PCB)主要存在于PC,APC和PEC中,藻尿膽素(phycourobilin,簡稱PUB)主要存在于B-PE和R-PE中,藻紫膽素(phycoviolobilin,簡稱PVB)僅存在于PEC中。這四種色素互為同分異構體,它們的差異表現在雙鍵的位置和數目,從而導致不同藻膽色素間吸收波長的差異。它們可以高效地吸收紅光、綠光等葉綠素a(chlorophyll a,Chla)吸收較差的光區,為藻類的新陳代謝活動發揮著重要作用。

 以大腸桿菌體內血紅素為底物,通過外源導入含有hox1和pcyA基因的不同表達載體,從而在大腸桿菌體內構建藻膽色素的生物合成途徑。

藻膽色素生物合成途徑

2.藻膽色素的檢測與定量方法

采用紫外分光光度計及熒光分光光度計對其進行檢測和定量。藻膽色素具有共軛雙鍵體系,極易發生 π→π*,n→π*電子躍遷,因此可以利用熒光技術手段對其中的藻藍膽素和藻紅膽素進行檢測。此外,藻藍膽素和藻紅膽素在特定的溶液中具有特定的吸收峰,從而可以根據吸收峰的位置及吸光度對其定性、定量分析。

實驗操作步驟如下:

① 藻藍膽素的粗提:取 100 mL 的菌液,8000 g,離心 10 min 收集菌體。所得的菌體用 40 mL 甲醇在 50℃條件下,水浴加熱 1~2 h,至菌體沉淀呈白色,8000 g,離心,10 min 取上清待用;                       

 ② 特征吸收峰的測定:①中所得的藻藍膽素的甲醇溶液加入適量的濃鹽酸(VCH3OH:VHCl=95:5),測其紫外可見光吸收曲線;

③ 樣品濃度的計算:c(mM)=A680/37.9×稀釋倍數;

④ ①中藻藍膽素的甲醇溶液,測其紫外可見光吸收曲線,并根據吸收曲線測定其熒光發射光譜。

可見光波長范圍:390~760納米。

紅光:波長范圍:760~622納米;

橙光:波長范圍:622~597納米;

黃光:波長范圍:597~577納米;

綠光:波長范圍:577~492納米;

青光:波長范圍:492~450納米;

藍光:波長范圍:450~435納米;

紫光:波長范圍:435~390納米。

3.實驗用品

3.1.材料:菌種(E.coli,BL21)

3.2.器材和儀器:精準天平、紫外分光光度計、熒光光譜儀、pH計、紫外檢測儀、高速離心機、低溫恒溫槽、振蕩培養箱、凈化工作臺、高壓滅菌鍋

3.3.大腸桿菌培養基:

LB培養基(1L):10g NaCl,10g胰蛋白胨,5g酵母浸粉,加去離子水至1L。

TB培養基(1L):將12g胰蛋白胨,24g酵母浸粉,4mL甘油溶于900mL去離子水中,各組分溶解后高壓滅菌,冷卻至60℃左右,再加100mL滅菌的17mM KH2PO4和72mM K2HPO4的溶液(2.31gKH2PO4和12.54gK2HPO4)                             

3.4.抗生素儲備液

卡納霉素儲備液:用無菌二次重蒸水配成10mg/mL卡那霉素(kanamycin,簡稱Kan)溶液,分裝,-20°C保存備用。使用時每毫升培養基加入3~5mL,終濃度為30~50mg/mL。

4.實驗流程

4.1.活化菌種:取保藏的工程菌菌種10 μl接入裝有5 ml的LB液體培養基的試管(不同的藻膽蛋白生物合成需要不同的抗生素)中,于37℃搖床振蕩培養8-12小時。

4.2.擴大培養:將試管中活化的1 ml菌液接種到250 ml LB培養基,同時加入對應的抗生素,培養基于37℃搖床振蕩培養。

4.3.色素蛋白生物合成:工程菌培養至OD600約為0.5-0.6,10℃水浴中放置1 hr,加入IPTG至終濃度為1mmol/L,20℃低溫過夜誘導后離心收集細胞,二次蒸餾水洗兩次。

4.4.離心:把菌體從發酵液里離心出來。

第一次離心

(1)首先電子秤取50g菌液到離心管內

(2)將離心管放入離心機中

第二次離心

讓菌泥集中到一塊兒,方便取上清液

4.5.光譜分析  吸收光譜用紫外可見光譜儀,紫外可見光譜掃描范圍300~800nm,掃描速度960nm/min,狹縫寬度1.0nm。熒光光譜用熒光光譜儀,熒光光譜掃描速度1200nm/min ,狹縫寬度5.0nm。

 結果分析

1. 在第一次離心后大腸桿菌菌落呈現藍色和紅色

2.第二次離心后得到更為明顯的紅藍清液

3.吸收和熒光圖譜

藻藍膽素在酸性甲醇溶液中,于680 nm 處的吸收峰是藻藍膽素的特征吸收峰,藻紅膽素在酸性甲醇溶液中,于440nm處的吸收峰是藻紅膽素的特征吸收峰。

實驗總結

本實驗主要研究的是如何從大腸桿菌中提取藻膽色素。藻膽色素既可作為抗氧化劑應用于食品、保健品領域,又可作為熒光探針應用于疾病診斷和光學治療領域,另外藻膽素還能夠有效地減少肝損傷,促進肝細胞的增殖。藻膽素在細胞或者生命體內還可以被還原為一種類似于膽紅素的物質,能夠有效地抑制 NADPH氧化酶的活性,進而可以減少或治療某些NADPH酶導致的疾病,因此藻膽色素具有廣闊的應用前景和巨大的商業市場價值。

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